【聚合氯化鋁】
在污水處理中，由于硝化細菌是自養異養細菌且生長緩慢，容易流失，所以近年來固定化微生物技術的應用越來越受到人們的關注.固定化微生物技術是通過化學或物理的手段, 將微生物細菌限定于載體空間區域內，保持其活性并且可以反復利用.與傳統生物處理法相比，固定化微生物技術具有微生物流失少、污泥產量少、抗沖擊負荷能力強等優點，可以包埋預先篩選出的特種菌種，運用于污水處理系統中.目前，包埋固定化硝化細菌處理氨氮廢水成為國內外學者的研究焦點.郝婧所用的包埋固定化硝化細菌處理高氨氮廢水，在反應溫度為28~30℃，pH為8.2，包埋顆粒體積填充率為25%的條件下，氨氧化速率*高約30 mg·(L·h)-1.利用固定化氨氧化細菌進行含氮廢水短程硝化時發現，溫度為30℃，pH為8.5時亞硝酸鹽氮積累率可達90%以上，氨氧化速率*高約為7.9 mg·(L·h)-1.Inoue等以聚乙烯醇為載體固定硝化細菌，填充率為50%時處理低溫氨氮廢水，硝化速率為17 mg·(L·h)-1.由此可見包埋硝化細菌處理氨氮廢水反應效率通常較低，且包埋后需嚴格控制反應條件，達到亞硝酸鹽氮的高積累.
因此，包埋硝化細菌實現短程硝化是可行的.但硝化細菌中氨氧化細菌含量較少，嚴重影響了硝化速率.為此，本實驗研究氨氧化細菌的包埋固定化.以水廠回流污泥為菌源，定向篩選AOB并淘汰NOB，以期達到細菌包埋完成后能實現較高的氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率.
1 材料與方法1.1 污泥來源與實驗裝置
實驗污泥取自北京高碑店處理廠硝化污泥.污泥富集培養連續流裝置見圖 1，反應池有效容積22 L.
圖 1 污泥富集培養裝置示意
污泥富集培養實驗采用人工模擬氨氮廢水，主要成分有: NH4Cl(投加量取決于NH4+-N濃度)，Na2CO3(投加量取決于NH4+-N濃度)，K2HPO4、KH2PO4(投加量取決于NH4+-N濃度，其中N:P為5)，MgSO4·7H2O(20mg·L-1)，CaCl2·2H2O(10mg·L-1).每升進水中加入0.5 mL微量元素，其中ZnSO4·7H2O(0.12 mg·L-1)，NaMoO4·2H2O(0.12mg·L-1)，CoCl2·6H2O(0.15mg·L-1)，MnSO4·H2O(0.12mg·L-1)，NiCl2·6H2O(0.120 mg·L-1)，CuSO4·5H2O(0.03mg·L-1)和FeCl3·6H2O(1.5 mg·L-1).
培養過程中反應溫度控制在25℃，DO為1~1.5 mg·L-1范圍內，pH為8~8.4.實驗起始時MLSS為4 030 mg·L-1，MLVSS為2 473 mg·L-1，實驗過程中每天連續排泥.初期進水氨氮濃度為100 mg·L-1，后逐步提高至700 mg·L-1.水力停留時間由4 h縮短到2 h.
1.2 包埋填料的制備與應用
按照本實驗室成熟的包埋技術，取7 L富集培養后的污泥進行離心濃縮，加入膠狀體聚乙烯醇(PVA)混合制成包埋液，均勻涂裝在條狀載體上，包埋液中PVA與濃縮污泥的濃度分別為10%和25%.以硼酸和無水硫酸鈉為交聯劑交聯4 h.包埋連續流裝置同上，包埋填料填充率為8%.實驗采用人工模擬氨氮廢水，其構成同上.實驗在室溫下進行，反應pH為7.2~8，DO為2~4 mg·L-1之間.實驗進水氨氮濃度由50 mg·L-1逐步提高至250 mg·L-1，HRT為4 h.為適應高碑店污水處理廠的實際進水氨氮濃度，在氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率穩定后，降低進水氨氮濃度至30~40 mg·L-1，并縮短水力停留時間至2 h.
1.3 實驗分析方法1.3.1 高通量測序分析方法
取原始污泥混合液和富集培養后的污泥混合液分別標記為Yu01和Yu02，提取DNA并對樣本16S rRNA的V3-V4區域進行PCR擴增.
采用Illumina HiSeq2500 PE250高通量測序平臺對樣品進行測序.針對測序數據進行環境微生物的16S分析，首先對原始的paired-end reads進行過濾得到高質量reads，然后通過序列拼接得到較長的序列，將其與16S參考數據庫作比對，同時去除嵌合體序列，*終將過濾后的序列按照一定的閾值進行歸類，得到多個序列聚類操作分類單元(OTUs)，設定閾值的序列相似性為0.97分為同一類，分成的一個類就是一個OTU，代表一個種.接著根據OTUs結果進行α多樣性的計算. α多樣性指標包括豐富度指數(ACE)、多樣性指數(Shannon、Simpson)、goods_coverage和observed_species等.其中豐富度衡量單個樣本中物種種類個數，實際通過估算OTU的個數來衡量;多樣性指數衡量群落的異質性. goods_coverage表示樣品文庫的覆蓋率，即測序深度指數，其數值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低. Observed_species代表該樣品中OTU的個數.
1.3.2 其他分析方法
NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測定;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定;NO3--N采用紫外分光光度法測定;pH采用SX711便攜式pH計測定;溶解氧采用JPSJ-605F型溶解氧儀測定.
2 結果與討論2.1 氨氧化細菌富集培養階段結果及分析2.1.1 進水氨氮濃度與污泥比氨氧化速率變化情況分析
從圖 2可以看出，反應起始階段(1~5 d)進水氨氮控制在100 mg·L-1，HRT為4 h，污泥比氨氧化速率開始由0.103 g·(g·d)-1緩慢增長至0.348 g·(g·d)-1.此時還處于活性恢復階段，為了提高污泥比氨氧化速率，從第6 d開始提高進水氨氮濃度并將HRT縮短為3 h.至第22 d，由于污泥比氨氧化速率增長較快，提高進水氨氮濃度至400 mg·L-1并同時縮短HRT至2 h并保持不變.
圖 2 污泥進水氨氮濃度及污泥比氨氧化速率變化
經過30 d的富集培養，污泥比氨氧化速率呈對數增長至1.368 g·(g·d)-1.隨著污泥比氨氧化速率的不斷提高，在水力停留時間2 h內出水氨氮濃度逐漸減小為零，此時反應較易向全程硝化轉化.所以繼續增加進水氨氮濃度至500 mg·L-1，此時污泥比氨氧化速率增長緩慢，說明高濃度氨氮對氨氧化細菌的活性有一定抑制作用.而后繼續增加進水氨氮濃度至700 mg·L-1，可以發現在短暫的適應期過后，污泥比氨氧化速率繼續增長，*終高達2.028 g·(g·d)-1.污泥比氨氧化速率的持續增長可以證明富集培養階段氨氧化細菌活性不斷增強.
2.1.2 污泥濃度變化情況分析
由于反應體系中始終保持著較高濃度的亞硝酸鹽氮，作為NOB的反應底物，亞硝酸鹽氮的積累對NOB的生長有一定的促進作用.為了將NOB徹底淘洗出去，實驗過程中每天不斷排泥.從圖 3可以看出，前23 d系統中MLVSS不斷增長，這是由于前期排泥量較小.為保持系統中穩定的污泥濃度，第24 d開始加大排泥量，污泥濃度逐漸減小，至第35 d基本穩定.盡管每天不間斷排泥，系統總污泥濃度仍不間斷增長，后由高通量測序可知污泥中氨氧化細菌大量增長.
圖 3 污泥濃度變化
2.1.3 污泥亞硝酸鹽氮積累率變化情況分析
從圖 4可以看出，反應起始階段(1~5 d)亞硝酸鹽氮積累率由33%迅速增長至70%.從第6 d開始提高進水氨氮濃度后，亞硝酸鹽氮積累率進一步增加至85%以上并逐漸穩定.此后由于氨氮濃度不斷提高，FA對NOB的抑制作用不斷增大，且每天不間斷地排泥，致使NOB活性越來越低且數量越來越少.而此時氨氧化細菌大量增長且活性不斷增強，在系統中占有明顯的生態優勢.這使得亞硝酸鹽氮積累率從第20 d起始終保持在90%以上.
圖 4 污泥亞氮積累率變化
本實驗進行至第60 d，污泥比氨氧化速率的高表達和亞硝酸鹽氮的高積累已達到預期效果，此時取污泥樣品進行高通量測序，結果表明氨氧化細菌已成為優勢菌種，可以進行后續包埋實驗.另外，本實驗污泥富集培養階段出水用于反硝化實驗，脫氮后排放.
2.1.4 污泥多樣性及菌群變化分析
通過對兩組樣品16S rRNA基因文庫高通量測序，污泥原樣(Yu01) 與富集培養后的污泥樣品(Yu02) α多樣性指標計算結果見表 1.
表 1 α多樣性指標計算結果
由表 1可知，兩個樣品的文庫覆蓋率均大于0.98，表明測序深度已經基本覆蓋到樣本中所有的物種. Yu01的Shannon多樣性指數和Simpson多樣性指數大于Yu02，說明原污泥群落多樣性高于篩選后的污泥.多樣性指數較高的原始污泥群落各種之間個體分配較均勻，而篩選后的污泥各種之間生物量差異較大，優勢種群明顯.
為了更深入研究系統的優勢菌種，計算每個樣本在屬級的相對豐富度. 表 2、表 3列出了每個樣品前三類優勢菌屬及與硝化作用相關的Nitrospira和Nitrosomonas所占百分比及系統分類.
表 2 Yu01優勢菌屬
表 3 Yu02優勢菌屬
與常規分子生物學手段相比，高通量測序可以提供更豐富的微生物信息.盡管如此，Yu01與Yu02仍有50.5%與51.4%的序列無法歸入已知細菌屬.原泥樣品菌群分布較均勻，均為廢水處理系統中的常見菌種.其中與硝化作用相關的為Nitrospira和Nitrosomonas.已知的Nitrospira菌屬為硝酸鹽氧化細菌，Nitrosomonas菌屬為氨氧化細菌，前者為后者的11.25倍.篩選后的污泥樣品中，Nitrosomonas成為優勢菌，這與Wells等的研究結果一致，即絕大多數反應器中Nitrosomonas是AOB的優勢菌種.而Nitrospira僅占系統的0.02%，此時Nitrosomonas是Nitrospira的900倍.
2.2 包埋氨氧化細菌短程硝化階段結果及分析2.2.1 包埋填料短程硝化效率與亞氮積累率變化情況
對包埋填料進行活性恢復.由圖 5可知起始階段系統進水氨氮濃度為50 mg·L-1，氨氧化速率由1 mg·(L·h)-1緩慢增加至6 mg·(L·h)-1.此時氨氧化速率較低，從第12 d起為提高反應速率將進水氨氮濃度增加至100 mg·L-1，可以發現隨著氨氮濃度的增加，氨氧化速率增長加快，至第19 d迅速增長至20 mg·(L·h)-1.因此，通過逐步增加進水氨氮濃度的方法提高氨氧化速率是可行的.此后繼續階段性地提高進水氨氮濃度至250 mg·L-1，氨氧化速率*可高達50 mg·(L·h)-1.
圖 5 包埋填料氨氧化速率變化
從圖 6可以看出，實驗過程中系統始終保持95%以上亞硝酸鹽氮積累率.證明系統中氨氧化細菌始終保持著**的生態優勢.由此可以證明，包埋固定本實驗篩選后的氨氧化細菌有利于實現硝化系統中穩定的亞硝酸鹽氮積累.
圖 6 包埋填料亞氮積累率變化曲線
2.2.2 模擬水廠進水氨氮濃度下的處理效果
為適應高碑店污水處理廠的實際進水氨氮濃度，在氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率穩定后，降低進水氨氮濃度至30~40 mg·L-1.由圖 7、8可以看出，系統始終保持著90%以上的氨氮去除率以及亞硝酸鹽氮積累率.
圖 7 系統氨氮去除率變化
圖 8 系統亞氮積累率變化
3 結論
(1) 采用連續流運行方式逐步提高進水氨氮濃度，可以促進氨氧化細菌活性的增強并使之大量增長，從而大大地提高氨氧化速率，但高濃度氨氮對氨氧化細菌的活性有一定的抑制作用.具體參見資料或更多相關技術文檔。
(2) 固定化富集培養后的氨氧化細菌，反應器包埋填充率為8%時，氨氧化速率*高可達50 mg·(L·h)-1，亞硝酸鹽氮積累率穩定在90%以上.
(3) 用包埋填料處理水廠模擬污水，氨氮去除率和亞硝酸鹽氮積累率均可保持在90%以上.
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