【聚合氯化鋁】
隨著能源危機與環境污染的加劇, 微藻生物柴油越來越受到各國研究者的關注.就整體工藝而言, 微藻生物柴油的生產包括藻種選育、微藻培養、微藻收獲、油脂提取與轉脂.微藻培養是其中一個重要環節, 在微藻培養過程中, 利用淡水培養微藻需消耗大量淡水資源, 有悖于當前淡水資源緊缺的背景.同時, 營養物質的投加進一步提高了微藻的培養成本.
城市污水中含有大量的氮、磷營養物質, 利用城市污水培養微藻, 可在水質凈化的同時, 為微藻的生長提供豐富的氮、磷, 同時污水中的細菌可分解污水中的有機物產生CO2, 為微藻提供生長所需碳源.相比于利用人工配制的培養基并外加純CO2氣體進行微藻的培養, 利用城市污水培養微藻可一定程度降低微藻培養的成本, 又可依托現有污水處理廠規模化培養, 是當前解決水環境污染和能源危機的一個有效途徑.目前, 此領域的大多數研究集中在利用微藻改善污水水質或者利用人工污水培養基及滅菌污水培養微藻方面, 而將實際城市污水處理與微藻培養制備生物柴油相耦合的研究報道較少. Mahapatra等利用滅菌的城市污水培養混合藻類, 培養12 d, 微藻產率為122 mg·(L·d)-1. Ryu等研究表明, 相較于滅菌的初沉池污水, 小球藻在未滅菌的城市污水中生長得更好, 微藻產率為126 mg·(L·d)-1, 油脂含量達到20.59%.
由于城市污水成分復雜, 固體顆粒含量高時, 相應的營養物質含量較高, 有利于微藻生長, 但也會增加污水濁度, 影響微藻對光的有效吸收.同時, 污水中含有大量的微生物, 微藻與細菌之間存在著互生、拮抗等復雜的相互關系.且不同藻種對環境需求不同, 對污水的耐受性也不同.因此, 需要篩選出適宜于城市污水培養和高效產脂的藻種, 并對城市污水預處理方式進行研究, 以使預處理后的城市污水更適于微藻的生長與產脂.因此本研究將從課題組前期獲得的斜生柵藻與蛋白核小球藻原始株及其離子注入誘變株中根據其在實際城市污水中的生長與產脂情況以及對污水的凈化能力篩選出適宜于城市污水培養的藻種, 并根據藻種性能研究適于微藻生長與產脂的可規模化擴大的污水預處理方式, 以期為城市處理與微藻生物能源耦合工藝的建立奠定基礎.
1 材料與方法1.1 藻種與培養基
試驗所用微藻為購買于中科院(武漢)水生生物研究所淡水藻種庫的斜生柵藻原始株(SC-W)與蛋白核小球藻原始株(CH-W)以及課題組前期經離子注入法誘變篩選的斜生柵藻誘變株(SC-M)與蛋白核小球藻誘變株(CH-M), 藻種采用BG-11培養基進行傳代培養保藏.
試驗所用城市污水取自深圳大學城市政污水井, 經潛污泵抽取后使用.污水水質見表 1.
表 1 大學城城市污水水質
1.2 試驗方法1.2.1 微藻培養
以BG11培養基培養處于對數生長期的微藻為種子液, 接種于600 mL城市污水, 于氣泡柱式光生物反應器(直徑為5 cm、長度為50 cm、容積大小約為1 L)中培養, 以相應的不加微藻的城市污水為空白對照, 使扣除空白后藻液初始吸光度D680=0.1, 于培養溫度(25±1)℃, 光照強度100 μmol·(m2·s)-1, 光暗比(L:D)為12 h:12 h條件下, 連續通氣培養(空氣流速為120 mL·min-1, 由底部通入).每天取樣測定扣除空白后藻液的D680以監測藻細胞生長情況.取培養達到穩定期的藻液測定扣除空白后藻細胞的干重、油脂產量.每組試驗設3個平行對照.
1.2.2 污水預處理方法
城市污水采用以下5種預處理方式.原污水：經潛污泵除去粗大懸浮物后的原污水直接使用; 沉淀污水：原污水沉淀2 h后取上清液使用; 過濾污水：原污水用定性濾紙過濾后使用; 沉淀+過濾污水：原污水先沉淀2 h處理后, 上清液用定性濾紙過濾后使用; 滅菌污水：原污水經高壓蒸汽滅菌后使用.
1.3 分析方法1.3.1 微藻生長與干重的測定
通過測定D680來監測微藻的生長情況.微藻的干重采用重量法測定, 10 mL藻液經預稱重(W1) 的微孔濾膜(Φ0.45 μm)過濾、洗滌, 于105℃下烘至恒重(W2), 不加微藻的空白對照組干重為W0, 微藻干重DW (g·L-1)的計算公式如下：
1.3.2 微藻油脂產量與脂肪酸組成的測定
微藻油脂提取采用氯仿甲醇共溶劑提取法.待提取結束后, 收集氯仿相, 轉移至預稱重的錫紙盤中, 待有機溶劑揮發完全后, 于80℃烘箱中烘至恒重, 得到微藻油脂產量, 微藻細胞油脂含量為微藻油脂產量與微藻干重的百分比.
微藻脂肪酸分析, 首先對提取的油脂進行甲酯化, 將5 mL藻液中脂肪酸轉化成相對應的脂肪酸甲酯.采用賽里安456-GC氣相色譜儀進行分析, 色譜柱為BR-2560柱, 100 m×0.25 mm(內徑)×0.20 μm(膜厚), FID檢測器, 分流方式進樣, 分流比為30:1, 進樣量為1 μL.
1.3.3 常規水質指標測定
污水水質采用國標法測定.其中微藻培養結束后出水水質, 將微藻藻液于8 000 r·min-1離心10 min后, 收集上清液測定. TP、TN、NH4+-N、COD的測定分別參照GB 11893-89、GB 11894-89、GB 7479-87、GB 11914-89.
1.3.4 數據分析方法
數據采用統計軟件SPSS 21.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA), 采用LSD法進行統計檢驗(P 0.05).
2 結果與討論2.1 適于城市污水培養的藻種篩選2.1.1 城市污水中不同藻種的生長情況
將4種微藻CH-W、CH-M、SC-W、SC-M按照初始濃度D680=0.1分別接種到城市污水原污水中.每天測一次D680值監測其生長情況(圖 1).由圖 1可知, CH-M、CH-W、SC-W藻種在污水中生長情況良好, 具有較強耐污性能, D680*高可達1.5以上, 其中CH-M藻種D680*高.而SC-M藻種雖能保持持續生長, 但生長速率較低.后期的觀察發現, CH-W與CH-M分別于第9d進入快速衰亡期, 而SC-W、SC-M均可以長時間保持在生長穩定期.從穩定性培養的角度看SC-W、SC-M更具有優勢.
圖 1 微藻在城市污水中的生長情況
2.1.2 城市污水中不同藻種的產脂情況
取達到穩定期(第8 d)的微藻測其干重與油脂產量, 并計算其油脂含量, 結果如圖 2所示.對4種微藻的油脂進行甲酯化反應, 通過對生成的脂肪酸甲酯進行氣相色譜分析, 考察4種微藻脂肪酸組成的差異, 結果如表 2所示.
圖 2 微藻在城市污水中的產脂情況
表 2 藻株脂肪酸分析1)/%
由圖 2可知, 利用城市污水培養微藻, 微藻干重由大到小依次為SC-W、CH-M、SC-M、CH-W, 且彼此有顯著性差異(P 0.05).該排序與D680值排序不同, 主要由于藻種差異, 小球藻個體較小, 單個藻體質量較小, 斜生柵藻個體較大, 單個藻體質量大, 所以雖然D680值CH-M大于SC-W, 但微藻干重SC-W藻種大于CH-M藻種.微藻油脂含量由多到少依次為：CH-W、SC-W、CH-M、SC-M, 前三者無顯著性差異, 但明顯高于SC-M的油脂含量.兩者綜合而言, 所得微藻油脂產量大小依次為：SC-W、CH-M、CH-W、SC-M, 分別為0.43、0.33、0.27、0.17 g·L-1, 且彼此有顯著性差異(P 0.05).因此SC-W藻種在4種微藻中油脂產量*高, 是其他3種微藻油脂產量的1.3、1.6、2.5倍.從該試驗結果也可以看出, 經離子注入誘變后的小球藻能較好地保持其優良性能, 而經離子注入誘變后的斜生柵藻隨著時間推移, 藻種性能發生了退化.
由表 2可知, 4種微藻在脂肪酸組成上均以C16、C18為主, 為綠藻中常見脂肪酸. Song等和Ma等的研究表明, 適合制備生物柴油的原料應含有較多的C16~C18脂肪酸, 主要包括十六烷酸(C16:0)、十八烷酸(C18:0)、十八烯酸(C18:1)、十八碳二烯酸(C18:2)、十八碳三烯酸(C18:3). 4種微藻中該5種脂肪酸在總脂肪酸中的含量占比分別可達89.34%、90.55%、97.46%、94.81%, 適宜于作為制備生物柴油的原料.同時, 脂肪酸甲酯的結構會對生物柴油的性能(十六烷值、低溫流動性、氧化安定性等)產生影響.有研究表明, 生物柴油的十六烷值隨著飽和脂肪酸甲酯含量的增加而增加, 多不飽和脂肪酸甲酯含量的增加而降低.生物柴油低溫流動性隨著飽和脂肪酸甲酯尤其是長碳鏈質量分數增高而變差.生物柴油的氧化安定性隨著不飽和脂肪酸不飽和度增高而變差.高品位的生物柴油應盡量少地含有多不飽和脂肪酸甲酯和飽和脂肪酸甲酯, 盡量多地含有單不飽和脂肪酸, 以改善其十六烷值、低溫流動性、氧化安定性、運動黏度等性能.根據歐盟對生產生物柴油原料的嚴格要求(EN 14214), 亞麻酸甲酯(C18:3) 含量需不超過12%, 多不飽和甲基酯(≥4個雙鍵)含量需不超過1%, 以改善生物柴油的氧化安定性.從表 1中可以看出, 除了SC-M的C18:3含量略大于12%, 其它均小于12%. 4種微藻聚不飽和甲酯(≥4個雙鍵)含量均不超過1%.值得一提的是, 微藻油脂的脂肪酸組成并非是固定不變的, 脂肪酸組成會隨著培養條件以及油脂提取條件的變化而變化.因此, 可以通過培養條件優化來改善微藻油脂的脂肪酸組成, 提高其中單不飽和脂肪酸甲酯的含量, 以制備更高品位的生物柴油.
2.1.3 城市污水培養微藻后污染物去除情況
城市污水培養微藻后, 污水中的COD、NH4+-N、TN、TP去除情況如表 3所示.從中可知, 微藻可以起到很好的水質凈化作用, 尤其以CH-M藻種與SC-W藻種污水處理能力*佳, 可使污水中COD去除率達到80%以上, TN、TP去除率達到93%以上.由于微藻培養過程保持堿性環境, 氨氮部分變成氨氣, 在吹脫作用下從水中去除, 因此NH4+-N的去除效果*好, 微藻培養結束后污水中已檢測不到.
表 3 城市污水培養微藻后污染物的去除情況/%
綜合而言, SC-W與CH-M藻種在城市污水中具有較好的生長與產脂性能, 同時對污水有較好的凈化效果, 為適宜于城市污水培養的高效藻種.
2.2 城市污水培養微藻污水預處理2.2.1 沉淀、過濾預處理
城市污水采用原污水、沉淀污水、過濾污水、沉淀+過濾污水這4種預處理方式, 預處理后的污水水質情況如表 4所示.將SC-W、CH-M按照初始濃度D680=0.1分別接種到不同預處理方式處理后的城市污水中, 取穩定期的藻液測其微藻干重, 油脂產量并計算其油脂含量.所得結果如圖 3、圖 4所示.
圖 3 SC-W在不同預處理方式城市污水中產脂情況
圖 4 CH-M在不同預處理方式城市污水中產脂情況
表 4 城市污水預處理后水質/mg·L-1
由表 4可知, 城市污水中COD含量經沉淀處理后變化不大, 經過濾、沉淀與過濾聯合處理后降低.城市污水中NH4+-N、TN、TP含量經沉淀、過濾處理后有所降低, 經沉淀與過濾聯合處理后進一步降低.總體而言, 原污水中氮、磷等營養物質較為豐富, 但懸浮物也較多, 隨著處理程度的加深, 懸浮物減少, 但污水中的營養物質損耗也會相應增加.
由圖 3、圖 4可知, 不同的微藻具有不同的耐污性能, 對污水預處理程度的要求也不同. SC-W在原污水中生物質產量*高, 當使用沉淀、過濾單種預處理方式處理污水后, 會造成微藻干重的降低, 當使用沉淀與過濾聯合預處理方式處理污水后, 會造成微藻干重的進一步降低.由此可以看出斜生柵藻具有較強的耐污性能, 當污水中營養物質越豐富時, 生長越好.微藻油脂產量由微藻生物質產量和微藻油脂含量共同決定, 四種預處理方式中, 原污水預處理方式微藻生物質產量*高, 微藻油脂含量較高, 所以總的微藻油脂產量*高, 為0.19 g·L-1.因此, 城市污水可不經沉淀、過濾處理, 直接除去粗大懸浮物后作為培養基用于SC-W的培養.而CH-M在原污水中的干重*低, 當經沉淀、過濾單種預處理方式處理污水后, 干重有所提高, 當使用沉淀與過濾聯合預處理方式處理污水后干重*高. 4種預處理方式中, 沉淀與過濾聯合處理方式, CH-M油脂產量顯著高于其它3組(P 0.05), 為0.16 g·L-1.由此可以看出, 小球藻比較喜歡相對潔凈的環境, 當污水中濁度越低時, 生長越好.試驗中發現污水濁度較高試驗組, CH-M更易于沉淀, 因此不利于其與營養物充分接觸, 會對其生長產生影響.因此, 城市污水經沉淀+過濾預處理后更適合作為培養基用于CH-M的培養.
2.2.2 滅菌預處理
微藻與細菌之間存在互生、拮抗等復雜的相互關系.菌藻的互生關系表現在微藻通過光合作用釋放出氧氣供給細菌進行代謝活動, 而細菌將水中有機污染物降解轉化為二氧化碳、無機氮、磷化合物等, 為微藻提供光合作用所需的碳源和營養, 如此循環, 形成藻菌之間互生的關系.菌藻拮抗關系表現在, 微藻能夠產生抑制細菌生長的抗生素類物質, 且微藻生長會導致pH與溶解氧的升高, 從而抑制某些細菌的生長等, 而細菌也可能通過釋放可溶解纖維素的酶等胞外物抑制甚至裂解藻細胞, 或在生長過程中, 附著于反應器內壁, 阻礙光線的透射, 從而影響微藻的光合生長.為消除細菌對微藻的影響, 文獻中常對污水采取滅菌預處理.但滅菌預處理也存在著成本高、難以擴大的問題.
對城市污水進行滅菌預處理, 以原污水作為對照.將SC-W、CH-M按照初始濃度D680=0.1分別接種到不同預處理方式處理后的城市污水中, 取穩定期的藻液測其微藻干重, 油脂產量并計算其油脂含量.所得結果如圖 5、圖 6所示.
圖 5 SC-W在不同預處理方式城市污水中產脂情況
圖 6 CH-M在不同預處理方式城市污水中產脂情況
由圖 5、圖 6可知, 與不同的微藻具有不同的耐污性能相似, 滅菌對不同微藻的生長與產脂的影響也不同.耐污性能較強的SC-W在原污水中生物質與油脂產量高于滅菌污水中的生物質與油脂產量, 油脂含量兩者相差不大, 滅菌組略高.故SC-W在原污水中油脂產量較高主要歸因于其生物質產量較高, 說明城市污水中的細菌對SC-W的生長有促進作用, 該結論與Ryu等所得結論一致.而CH-M在滅菌污水中生物質產量較高, 說明城市污水中的細菌對CH-M的生長有一定的抑制作用.滅菌組與原污水組的油脂產量無顯著性差異.
綜合考慮微藻在不同污水預處理方式下的生物質與油脂產量及污水預處理的成本與可操作性.對于SC-W, 除去粗大懸浮物后的原污水可以不經過任何處理, 直接用于SC-W的培養, 該結果對于低成本的微藻培養十分有利.對于CH-M, 沉淀+過濾預處理、滅菌預處理方式下, CH-M的生物質產量較高, 且沉淀+過濾預處理方式下, CH-M油脂產量略高于滅菌預處理(P 0.05).同時考慮到污水滅菌處理的高成本、難以擴大, 原污水可經沉淀+過濾預處理后用于CH-M的培養.具體參見資料或更多相關技術文檔。
3 結論
(1) 斜生柵藻、蛋白核小球藻原始株及經離子注入誘變的誘變株均可在實際城市污水中生長.其中斜生柵藻原始株、蛋白核小球藻原始與誘變株生長情況較好, D680可達1.5以上, 斜生柵藻原始與誘變株生長穩定性較好, 可較長時間保持在穩定期.
(2) 斜生柵藻原始株與蛋白核小球藻誘變株生物質與油脂產量較高, 且含有較多的C16-C18脂肪酸, 適宜于生物柴油的制備.經離子誘變后的蛋白核小球藻能較好地保持其優良性能, 而經離子誘變后的斜生柵藻隨著時間推移, 藻種性能發生了退化.
(3) 微藻可以起到很好的水質凈化作用.尤其以蛋白核小球藻誘變株與斜生柵藻原始株的污水處理能力*佳, 可使污水中COD去除率達到80%以上, TN、TP去除率達到93%以上.其中NH4+-N的去除效果*好, 微藻培養結束后污水中已檢測不到.
(4) 不同藻種所*適的污水預處理方式不同.綜合考慮微藻在不同污水預處理方式下的生物質與油脂產量及污水預處理的成本與可操作性, 對于耐污性能較強的斜生柵藻原始株, 除去粗大懸浮物后的原污水可直接用于其培養.對于蛋白核小球藻誘變株, 經沉淀+過濾預處理后的城市污水適宜于其培養.
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